Przegląd Lekarski 2018 / 75 / 11 549
Joanna Margasińska-Olejak
Danuta Wiechuła
Agnieszka Fischer
Katedra i Zakład Toksykologii i Bioanalizy,
Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem
Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu,
Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach
Kierownik:
Dr hab. n. med. Jerzy Stojko
Dodatkowe słowa kluczowe:
włosy
narkotyki
metody instrumentalne
Additional key words:
drugs
hair
instrumental methods
Adres do korespondencji:
Joanna Margasińska-Olejak
ul. Kossutha 6, 40-844 Katowice
tel: 509 913 565, 32 203 21 66
fax: 32 203 21 66
e-mail: Ten adres pocztowy jest chroniony przed spamowaniem. Aby go zobaczyć, konieczne jest włączenie w przeglądarce obsługi JavaScript.
prace poglądowe
Wykorzystanie włosów do analizy substancji
psychoaktywnych
The human hair use for psychoactive substances
analysis
Autorzy nie deklarują konfliktu interesów
Otrzymano: 27.07.2018
Zaakceptowano: 10.12. 2018
W pracy scharakteryzowano możliwość wykorzystania włosów jako
materiału do badań toksykologicznych, ze szczególnym uwzględnieniem substancji psychoaktywnych.
Na przestrzeni lat nastąpił znaczący
rozwój rynku narkotykowego i problemów związanych z narkomanią.
Proces ten wymusza poszukiwanie
coraz to dokładniejszych i bardziej
wiarygodnych technik analitycznych, zakłada także wykorzystanie
różnorodnych, także alternatywnych tkanek do badań. Zaprezentowane opracowanie materiałów literaturowych przedstawia możliwości
wykorzystania włosów w celu identyfikacji substancji psychoaktywnych. Praca charakteryzuje proces
inkorporacji ksenobiotyków do tkanek włosa, a także prezentuje zalety oraz ograniczenia związane z ich
użyciem oraz przeprowadzeniem
analizy. W pracy scharakteryzowane
zostały także główne metody analityczne i kierunki zastosowania analizy włosów do wykrywania narkotyków w organizmie.
The work is about the possibility
of using hair as a material for toxicological tests, with particular emphasis
on drugs. Over the years, there has
been a significant development of the
drug market and problems related to
drug addiction. This process forces
the search for more and more accurate and reliable analytical techniques,
also assumes the use of a wide variety, including alternative tissue for
research. The presented study based
on literature reports presents the possibilities of using the hair to identify
the body’s exposure to the drugs. It
describes the process of drug incorporation into the hair tissues, also
the advantages and limitations associated using the hair to the analysis.
The analytical methods and main directions of hair analysis for drug detection in the body were also characterized.
Wstęp
Sukcesywne rozpowszechnienie zjawiska narkomanii, powoduje konieczność
poszukiwania nowych metod analitycznych, które umożliwią pełną diagnostykę.
U osób uzależnionych, oprócz standardowych analiz krwi czy moczu, coraz częściej
wykorzystuje się w badaniach materiały alternatywne, do których należą m.in. włosy
[1-3].
Dokładne poznanie budowy i cyklu
wzrostu włosa wskazuje, że ksenobiotyki
dostarczane do organizmu, niezależnie
od drogi narażenia, mają zdolność wbudowywania się w jego strukturę. Jest to
niezwykle istotna cecha umożliwiająca
wykorzystanie analizy włosów w różnych
badaniach, w tym także tych z zakresu
medycyny sądowej. Segmentowa analiza
włosów pozwala na retrospektywną ocenę zażywania leków w celach medycznych. Wartość tych badań została doceniona także w przypadku konieczności
potwierdzania zażywania substancji psychoaktywnych w celach niemedycznych.
Współcześnie analiza włosów nie należy
do rutynowej diagnostyki, ale specyficzne
właściwości przemawiają za wprowadzeniem tego badania jako standardu w praktyce laboratoryjnej.
W ostatnich latach nastąpił znaczny
rozwój wysokoczułych metod chromatograficznych wykorzystywanych w analizie
ksenobiotyków w organizmie [3,4]. Jednymi z najczęściej stosowanymi spośród
nich są: wysokosprawna chromatografia
cieczowa (HPLC) oraz chromatografia gazowa (GC). Bardziej precyzyjne wyniki uzyskuje się w przypadku sprzężenia chromatografii z metodami spektralnymi, takimi jak
np. spektrometria mas (MS). Także udoskonalenie wydajności procesów ekstrakcji
ksenobiotyków, znacznie zwiększa przydatność włosów jako materiału do badań.
Celem pracy było zaprezentowanie
włosów jako alternatywnego materiału do
badań laboratoryjnych prowadzonych pod
kątem narażenia organizmu na substancje
o działaniu psychoaktywnym. Dzięki stałemu udoskonalaniu metod diagnostycznych
przewiduje się, iż włosy staną się materiałem coraz powszechniej stosowanym
w przypadku kontroli osób uzależnionych
czy poddanych leczeniu odwykowemu
związanym z zażywania substancji psychoaktywnych.
550 J. Margasińska-Olejak i wsp.
Początki zastosowania włosów
w analizie toksykologicznej
Geneza wykorzystania włosów do badań sięga XIX wieku i wywodzi się od działalności hiszpańskiego toksykologa Mateo
Orfili, który jako pierwszy oznaczył zawartość arsenu we włosach [4,5]. Wszechstronne wykorzystanie włosów w kierunku
określenia zawartości metali przypadło
na lata sześćdziesiąte a w szczególności
na lata siedemdziesiąte i osiemdziesiąte
XX wieku. Włosy wykorzystywane były do
oceny narażenia na substancje toksyczne,
początkowo głównie do wykrywania pierwiastków takich, jak arsen czy rtęć. Z czasem analiza włosów została rozszerzona
o oznaczanie wielu substancji organicznych, w tym także narkotyków [1-6].
Pierwsze próby wykrywania substancji
narkotycznych - morfiny i heroiny we włosach prowadzono od roku 1978 za pomocą
metod radioimmunologicznych i mikrochemicznych [7]. Opracowanie metody enzymatycznego trawienia komórek znacznie
zwiększyło efektywność i spektrum tych
badań. Możliwość wykrycia we włosach
ludzkich fencyklidyny przy pomocy metod radioimmunologicznych wskazały badania Baumgartnera [7]. Z kolei w latach
1986 - 1989 zostały opracowane metody
umożliwiające identyfikację oraz analizę
we włosach metabolitów kokainy oraz innych związków o działaniu psychoaktywnym, takich jak metamfetamina, metadon
czy barbiturany.
Współcześnie odnotowuje się rozwój
metod przesiewowych, takich jak: metody
radioimmunologiczne (RIA), immunochemiczne (EMIT) i fluoroimmunochemiczne
(FPIA). Analiza włosów z wykorzystaniem powyższych metod jest obecnie powszechnie stosowana w medycynie sądowej, toksykologii klinicznej czy medycynie
komunikacyjnej [1].
Właściwości inkorporacyjne ksenobiotyków do struktury włosa
Włosy mają zdolność włączania ksenobiotyków w swoją strukturę. Przyjmuje się,
że zawartość substancji w 1 cm odcinku
włosa odpowiada dawce około miesięcznej
ekspozycji na daną substancję [3,6].
Pomimo szeroko prowadzonych badań
mechanizm inkorporacji ksenobiotyków we
włosy nie jest w pełni wyjaśniony. Obecnie
przyjmuje się trzy modele próbujące wyjaśnić ten proces. Podstawowym sposobem
inkorporacji ksenobiotyków we włosach
jest model, który zakłada wnikanie substancji chemicznych poprzez bierną lub
aktywną dyfuzję z krwi do cebulki włosa,
a następnie wiązanie ich z trzonem włosa
podczas procesu keratogenezy [8]. Zgodnie z tym modelem zawartość ksenobiotyku we włosach powinna być proporcjonalna do stężenia związku we krwi podczas
syntezy komórek [9]. Kolejny model sugeruje wnikanie ksenobiotyków na drodze dyfuzji z potu, łoju czy innych płynów
obmywających włosy już po ich wzroście
[10]. Przyjmuje się również, możliwość
przenikania substancji bezpośrednio ze
środowiska, głównie podczas przechodzenia do wnętrza korzenia przez łuskę włosa
[11]. Najbardziej prawdopodobna wydaje
się być kombinacja współdziałania ze sobą
tych trzech mechanizmów [3,8,12].
Niezależnie od mechanizmu, inkorporacja ksenobiotyków do włosów podlega
farmakokinetycznym zasadom dystrybucji. Lipofilowe cząsteczki organiczne łatwo
przenikają przez błony biologiczne i ulegają rozproszeniu w zależności od gradientu
ich stężeń. Natomiast cząsteczki lub jony
hydrofilowe o średniej masie cząsteczkowej nie przechodzą przez membrany
[3]. Generalnie przyjmuje się, że związki
o charakterze zasadowym znacznie łatwiej i w większym stopniu wbudowują się
w strukturę włosa niż związki o charakterze obojętnym czy kwasowym [12]. Na
przykład heroina oraz jej metabolit 6- monoacetylomorfina (6-MAM) są trudne do
wykrycia w moczu czy krwi, ale mogą być
diagnozowane we włosach. Trudność wykrywania heroiny i 6-MAM wynika także
w dużym stopniu z bardzo krótkiego biologicznego okresu półtrwania w płynach biologicznych (poniżej 5 minut). Również metamfetamina, która w roztworze wodnym
ma charakter zasadowy, wnika we włosy
znacznie łatwiej niż inna pochodna amfetaminy o charakterze kwasowym - acetyloamfetamina. Podobnie fencyklidyna (PCP)
czy 3,4- metylenodioksymetamfetamina
(MDMA) łatwiej inkorporują we włosy niż
związek o charakterze kwasowym - tetrahydrokannabinol [9].
Po etapie inkorporacji, podczas procesu okluzji i keratynizacji ksenobiotyki są
stopniowo zatrzymywane w łodydze i przemieszczają się w trakcie wzrostu włosa.
Proces ten powoduje, że skład łodygi włosa, nawet po jego wydostaniu się ponad
powierzchnię skóry, nie ulega zmianie [13].
Dodatkowym czynnikiem wpływającym
na inkorporację narkotyków jest zawartość
melaniny we włosach. Analiza włosów siwych, niezawierających pigmentu, wskazuje na około dziesięciokrotnie niższe stężenie narkotyku niż w przypadku włosów
zawierających melaninę, mimo jednakowego narażenia i takiego samego stężenia
substancji we krwi osób badanych [13,14].
Wykazano również różnice w stężeniu danej substancji we włosach w zależności od
ich struktury czy porowatości, a także w zależności od stosowanych zabiegów kosmetycznych [9].
Zakres zastosowania badań włosów
Ze względu na dużą trwałość i łatwość
przechowywania włosy stanowią cenne
źródło informacji w badaniach kryminalistycznych, toksykologicznych, a także
archeologicznych. Wprowadzenie czułych
metod badawczych umożliwiło zastosowanie włosów do analizy nie tylko jakościowej, ale także ilościowej różnych substancji chemicznych, w tym metali toksycznych,
pestycydów, pierwiastków promieniotwórczych [6]. Ich analiza pozwala na ocenę
w aspekcie stanu zdrowia organizmu człowieka. Może służyć do wykrywania środków psychoaktywnych, leków czy środków
dopingujących [6,7].
Badania z użyciem włosów mają szerokie zastosowanie w wykrywaniu narkotyków. Pozwalają bowiem na identyfikację
substancji nawet u osób korzystających ze
środków odurzających okazjonalnie. Dzięki
wynikom analizy można nie tylko potwierdzić zażywanie narkotyków czy zróżnicować pacjentów na osoby uzależnione oraz
przyjmujące te środki okazjonalnie. Można
także potwierdzić jednorazowe przyjęcie
substancji psychoaktywnych, jak to ma np.
miejsce w przypadku podania substancji
o działaniu obezwładniającym, określanych potocznie „pigułką gwałtu” [15,16].
Przykładem takiej substancji jest kwas
γ- hydroksymasłowy (GHB), który szybko
wchłania się do krwioobiegu i ma zdolność
do przenikania przez barierę krew-mózg.
GHB można wykryć we krwi i w moczu odpowiednio w ciągu 8 i 12 godzin od przyjęcia. W zawiązku z wykorzystywaniem tej
substancji w celu przestępczym zabezpieczenie materiału biologicznego i wykonanie badania w tak krótkim czasie po podaniu zazwyczaj nie jest możliwe. W takim
przypadku włosy są dogodnym materiałem
do badań. Określa się, że maksymalna długość włosów, która kwalifikuje je do badań
wynosi 24 cm, co odpowiada okresowi retrospekcji do około 2 lat. Po upływie tego
czasu istnieje ryzyko otwarcia się łusek
włosów i wypłukania substancji wbudowanych w ich strukturę [16,17].
Włosy mogą być także wykorzystywane jako materiał do badań pośmiertnych.
Sekcja zwłok może dostarczyć informacji
na temat przyczyny zgonu. Badanie krwi na
obecność leków czy narkotyków dostarcza
informacji o potencjalnym nadużyciu w niewielkim odstępie czasu przed zgonem, natomiast analiza włosa obrazuje używanie
substancji przez dłuższy okres czasu.
Analiza włosów może także dostarczyć
dowodów w celu ochrony osób nieletnich
weryfikując ich narażenie. Uzyskanie pozytywnego wyniku badania włosów lub smółki pobranych od noworodków potwierdza
nadużywanie środków psychoaktywnych
przez matkę w czasie ciąży. Ponadto,
z uwagi na fakt, że leki czy narkotyki ulegają transferowi do mleka, dzieci karmione
piersią mogą być narażone na działanie
substancji psychoaktywnych obecnych
w organizmie matki [18].
W tkankach włosa można oznaczyć
endogenne steroidy anaboliczne, takie jak
testosteron czy dehydroepiandrosteron,
jak i steroidy pochodzenia egzogennego
– stanozolol, mesterolon [19,20]. Są to
substancje, które często są używane jako
środki dopingujące. Ponadto możliwe jest
oznaczanie metali. Analiza pierwiastków
o znaczeniu fizjologicznym uściśla niedobory dietetyczne organizmu. Natomiast
stężenie metali ciężkich we włosach, stosuje się w celu oceny jakości środowiska
życia [6,10,21].
Pobieranie i przygotowanie próbek
włosów do badań
Analiza włosów jest procesem wieloetapowym obejmującym: pobieranie próbek, następnie dekontaminację (oczyszczanie), homogenizację (uzyskanie jednorodnej
próbki), ekstrakcję (wyizolowanie substancji
oznaczanej z matrycy włosa), oczyszcze-
Przegląd Lekarski 2018 / 75 / 11 551
nie izolatu oraz analizę jakościową i ilościową. Proces kończy się interpretacją
uzyskanych wyników [22].
1. Pobieranie próbek włosów:
Pobieranie włosów jest procesem prawie nieinwazyjnym. Nie wymaga zastosowania szczególnych warunków. Może być
przeprowadzony w obecności świadków,
nie wprowadza stanu skrępowania, co
może mieć miejsce w przypadku pobierania próbek moczu, a także krwi. Podczas
pobierania próbek włosów ograniczone
jest ryzyko zafałszowania czy zamiany materiału. Pobieranie próbek włosów nie musi
być wykonywane przez lekarza, natomiast
ważne jest, aby dokonywała tego osoba
odpowiednio przeszkolona [23]. Włosy nie
wymagają przechowywania w szczególnych warunkach, np. w obniżonej temperaturze i mogą być przechowywane przez
czas nieokreślony [22].
Naczelną organizacją, która zajmuje
się analizą włosów, jest The Society of Hair
Testing (SoHT) założone w 1995 r. Stowarzyszenie to publikuje szereg dokumentów
zawierających wskazówki dotyczące pobierania, przechowywania, obróbki wstępnej i analizy włosów [18].
Zgodnie z rekomendacjami SoHT zestaw do pobierania materiału biologicznego musi zawierać instrukcję pobierania
materiału, kopertę do zabezpieczania materiału, opakowanie zbiorcze oraz wymagane formularze. Próbki włosów powinny
być odcięte z tylnego wierzchołka głowy,
jak najbliżej skóry, gdyż jest to region o najmniejszej zmienności tempa wzrostu włosów. Preferowane jest pobieranie próbek
z głowy, jednak w przypadku gdy nie jest
możliwe pobranie ich z tej okolicy, możliwe
jest skorzystanie z miejsc alternatywnych,
takich jak włosy łonowe czy z okolicy pach.
Zaleca się, aby próbka włosów wynosiła
od 50 do 150 mg (ilość tą określa się jako
kosmyk odpowiadający grubości ołówka).
Należy dokładnie zanotować kolor, długość
włosów i miejsce, z którego zostały pobrane
oraz zaznaczyć część dystalną (końcówka
włosów) próbki. W przypadkach pobierania
włosów od denatów czynność tą wykonuje
się na początku sekcji zwłok. Próbki włosów, które są mokre, przed przechowywaniem i analizą muszą zostać wysuszone.
Suche włosy przechowuje się w ciemności,
w temperaturze pokojowej. Przechowywanie oraz transport próbek bądź ekstraktów
powinien odbywać w sposób, który zminimalizuje możliwość zanieczyszczenia czy
utratę analitu [18,24].
2. Przygotowanie próbek do analizy:
Po pobraniu włosy poddaje się czynnościom obejmującym oczyszczenie, segmentację (opcjonalnie) oraz utworzenie
z pobranego materiału właściwej próbki
do badań [18]. W przypadku wykorzystania włosów w celu identyfikacji substancji
psychoaktywnych głównym ograniczeniem
analizy są zanieczyszczenia zewnętrzne.
Istnieje możliwość, że substancja została biernie zaadsorbowana z otoczenia
zewnętrznego, co skutkuje uzyskaniem
fałszywie dodatniego wyniku. Dodatkowo
obecność pozostałości produktów kosmetycznych, pyłu, a także wydzielin (np. pot,
łój) może utrudnić analizę. W związku
z powyższym możliwość zanieczyszczenia
musi być uwzględniana w czasie analizy,
a także podczas interpretacji wyników.
Dekontaminacja próbki polega na użyciu rozpuszczalnika organicznego w celu
usunięcia zanieczyszczeń lipofilnych, takich jak woski, a następnie płukanie roztworem wodnym [23]. W miarę możliwości
rozpuszczalniki stosowane podczas tego
procesu powinny usuwać zanieczyszczenia zgromadzone na powierzchni włosa,
nie wpływając przy tym na substancje
zawarte wewnątrz [22]. Przyjmuje się, że
rozpuszczalniki organiczne (np. chlorek
metylenu, aceton) skuteczniej usuwają zanieczyszczenia z powierzchni włosa, natomiast roztwory wodne czy metanol umożliwiają wyodrębnienie substancji z macierzy
włosa. Laboratorium wykonujące badania
musi posiadać opracowaną procedurę
mycia włosów przed analizą, powinno się
także określić, w jakim stopniu stosowana
metoda usuwa zanieczyszczenia z powierzchni. Próbki mocno zabrudzone płynami ustrojowymi często wymagają dodatkowych procesów oczyszczania [18].
W celu oczyszczania próbki można
stosować rozpuszczalniki protonowe, takie
jak np. bufor fosforanowy i alkohole (etanol, metanol), które sprzyjają ekstrakcji
ksenobiotyków z wnętrza włosa na skutek
jego pęcznienia. Aprotonowe rozpuszczalniki (dichlorometan, aceton) nie powodują
pęcznienia, a więc nadają się do oczyszczenia powierzchni włosów z niechcianych
substancji, które mogą fałszować wynik
analizy [19,20].
Całkowity proces oczyszczania obejmuje serię płukań przy użyciu różnych
rozpuszczalników. Najczęściej stosuje się
procedury polegające na jedno- lub dwukrotnym przemyciu rozpuszczalnikiem
aprotonowym. Jednorazowe i krótkie przemycia stosuje się w przypadku rozpuszczalników protonowych. Do dekontaminacji stosować można również szampon
do mycia włosów, którego użycie wskazane jest do oznaczania m.in. amfetaminy,
kannabinoidów czy benzodiazepin [20,21].
W praktyce w procedurze oczyszczania
najczęściej stosuje się aceton, dichlorometan i wodę, które nie powodują wypłukiwania analitu z wnętrza włosa [18,22].
W następnym etapie próbkę włosów
tnie się na małe fragmenty o długości
1-3 mm lub rozdrabnia na jednorodny proszek. Sproszkowanie ułatwia procedurę
ekstrakcji polepszając penetrację rozpuszczalnika.
Etap ekstrakcji polega na długotrwałej
(5-18 godzinnej) inkubacji próbki w metanolu w łaźni ultradźwiękowej. Metanol wnikając do wnętrza włosa powoduje jego obrzęk
i uwolnienie substancji poprzez dyfuzję.
Zastosowanie ultradźwięków ma na celu
zmniejszenie wielkości cząstek, jak również
zmiany w strukturze włosów, co podnosi
efektywność procesu ekstrakcji [22].
Metody oznaczania substancji psychoaktywnych we włosach
Oznaczanie ksenobiotyków we włosach jest możliwe przy zastosowaniu odpowiedniej procedury przygotowania próbki
oraz użyciu właściwych metod analitycznych. Najczęściej wykorzystywaną metodą
są techniki chromatograficzne, szczególnie
wskazane w przypadku analizy opiatów,
kokainy, amfetaminy, marihuany i benzodiazepin. Metody chromatograficzne często stosuje się w połączeniu ze spektrometrią mas (MS). Przykładem może być
chromatografia gazowa sprzężona z spektrometrią mas (GC-MS), wysokosprawna
chromatografia cieczowa sprzężona ze
spektrometrią mas (HPLC-MS). W ostatnich latach stosuje się również sprzężenie
chromatografii z tandemową spektrometrią
mas (MS/MS) [9,10].
Wady i zalety zastosowania włosów
jako materiału do badań
Włosy są coraz powszechniej stosowane jako materiał biologiczny w przypadku wykrywania narkotyków w organizmie.
Stwierdza się bowiem, że substancje psychoaktywne wbudowane w strukturę włosa charakteryzują się znacznie szerszym
oknem detekcji w porównaniu z krwią
i moczem [25]. Włosy, jako materiał alternatywny lub materiał do badań uzupełniających pozwoliły na znaczne poszerzenie
spektrum badań toksykologicznych. Oznaczanie środków psychoaktywnych we włosach pozwala także na monitorowanie narkomanii w programach rehabilitacyjnych
osób uzależnionych [18]. Próbki włosów
są gromadzone w trakcie dochodzeń karnych, m.in. w opiniowaniu zgonów związanych z narkotykami, przestępczością narkotykową czy ochroną osób nieletnich [7].
W sprawach sądowego orzekania o byciu
pod wpływem narkotyków Zarząd Towarzystwa Society of Hair Testing wydał specjalne zalecenia dotyczące granicy oznaczalności substancji we włosach (Tab. I).
Rutynowo jako materiał do analizy toksykologicznej wykorzystywany jest mocz,
krew pełna, surowica lub osocze krwi.
Badanie pełnej krwi, osocza czy surowicy
dostarcza informacji o aktualnym stężeniu
danej substancji w organizmie. Natomiast
w przypadku analizy materiału, takiego jak
mocz oznacza się stężenie składników,
które uległy zagęszczeniu po opróżnieniu
pęcherza. Stężenie danej substancji w moczu w dużej mierze zależy od ilości przyjętych płynów przez osobę badaną. Prawie
nieinwazyjny sposób poboru oraz łatwa
dostępność materiału sprawiają, iż mocz
stanowi najczęściej stosowany materiał
biologiczny. W przypadku analizy środków
psychoaktywnych pobieranie moczu powinno być kontrolowane z uwagi na możliwość zafałszowania próbki. Procedura
ta może stanowić naruszenie prywatności
osoby badanej. Pozyskanie włosów pozawala na ograniczenie problemów etycznych. Zwraca się także uwagę na fakt, że
osoby przyjmujące długotrwale substancje psychoaktywne, które przed samym
badaniem zachowały abstynencję mogą
mieć ujemny wynik zawartości narkotyków
w moczu. Podczas analizy włosów natomiast może się zdarzyć w niektórych przypadkach, że pozostaną dodatnie. Analiza
włosów jest także przydatna, gdy środki
552
psychoaktywne stosowane są okazjonalnie
bądź w niewielkich dawkach. Do innych zalet zastosowania włosów do badań zalicza
się prosty i mało inwazyjny sposób ich pobierania, oraz brak ryzyka zakażenia organizmu, jak w przypadku kontaktu z krwią.
Włosy, które są materiałem mechanicznie
odpornym oraz obojętnym chemicznie nie
wymagają specjalnego sposobu przechowywania czy transportu, co znacznie ułatwia te procedury [26].
Oprócz szeregu zalet istnieją również
wady analizy włosów. Ze względu na różnice w szybkości wzrostu włosów w zależności od regionu anatomicznego, płci, wieku,
pochodzenia etnicznego, a także zmienności międzyosobniczej, interpretacja stężenia różnych substancji we włosach nie jest
łatwa. Ponieważ mechanizmy wprowadzania substancji do macierzy włosowej nie są
jeszcze w pełni poznane ogranicza to możliwości interpretacji wyników (szczególnie
ilościowych, w mniejszym stopniu jakościowych). Ponadto, jeśli brane są pod uwagę
także inne źródła pochodzenia ksenobiotyków niż te z krwioobiegu (jak wydzieliny
skórne czy zanieczyszczenia zewnętrzne
oraz środowiskowe), interpretacja staje się
wówczas jeszcze bardziej skomplikowana
[27]. Kolejne utrudnienie w analizie włosów
stanowi powszechne skażenie środowiska
niektórymi substancjami, jak np. nikotyną
z uwagi na obecność dymu tytoniowego
w powietrzu. Do zafałszowania wyników
badań mogą przyczynić się zabiegi kosmetyczne stosowane bezpośrednio na
włosach, szczególnie farbowanie i rozjaśnianie [11]. Ponadto brak standaryzacji
metod wykorzystywanych do oznaczania
tych samych analitów, trudności w akredytacji zgodnej z normą ISO 17025 czy
ISO 15189. Wyróżniając wady analizy włosów wskazuje się także na koszty badań,
które znacznie przewyższają badanie moczu czy krwi. Ponadto analiza włosów jest
procesem pracochłonnymi i skomplikowanym. Nie ma również możliwości wykrycia substancji spożytej bezpośrednio czy
krótko przed badaniem. Ograniczone jest
ponadto wykrycie danej substancji u osoby, która przyjęła środek jednokrotnie [12].
Dodatkowo zmienne stężenie melaniny,
może mieć wpływ na inkorporację środków
odurzających w strukturę włosów, a substancje o odczynie obojętnym lub kwaśnym
są słabiej adsorbowalne, co może wiązać
się z wykryciem ich w znacznie niższym
stężeniu [27]. Największym jednak problemem analizy włosów jest brak miarodajnej
interpretacji ilościowej. W praktyce na interpretację wyników analizy próbek włosów
wpływają zanieczyszczenia zewnętrzne,
a zatem interpretacja może prowadzić do
wyników fałszywie dodatnich. Konieczne
jest również opracowanie bardziej czułych
i selektywnych metod analitycznych.
Przykłady zastosowania analizy włosów w oznaczaniu narkotyków
Nieustannie rosnący problem narkomanii na świecie, także i w Polsce, powoduje
zaostrzenie zapobiegawczych przepisów
prawnych. Badania laboratoryjne umożliwiają wykrywanie środków psychoaktywnych i są wykorzystywane w celu potwierdzenia uzależnienia, a także są podstawą
do orzekania sądowego. W tym celu ważne jest opracowanie właściwych procedur,
które umożliwią oznaczanie zarówno narkotyków oraz ich metabolitów z użyciem
alternatywnych materiałów biologicznych
w stosunku do tych powszechnie używanych (krew czy mocz). Wartościowym materiałem w tym wypadku mogą być włosy.
Khajuria i Nayak [29] metodą GC-MS
analizowali zawartość morfiny we włosach
w celu ustalenia okresu czasu, w którym
będzie istniała możliwość jej wykrycia we
włosach. Próbki do badania pochodziły od
40 osób uzależnionych od opium. Kosmyki włosów zostały pobrane od pacjentów
3-krotnie w okresie badań, tj. w dniu analizy, po 45 dniach oraz po 90 dniach. Granica wykrywalności (LOD) wynosiła 0,26 ng/
mg. Dla wszystkich próbek uzyskano dodatni wynik, a zakres stężenia morfiny we
włosach wynosił od 0,26 ng/mg do 2,3 ng/
mg. Wyniki badań pozwoliły stwierdzić, że
morfinę można wykryć co najmniej 90 dni
po ostatnim jej przyjęciu [28].
Włosy są odpowiednim materiałem do
oznaczania kanabinoidów. Khajuria i Nayak [2] opublikowali wyniki badań z użyciem
metody GC–MS, które miały na celu określenie długości okresu utrzymywania się
Δ9-tetrahydrokanabilolu (THC) w ludzkich
włosach. Kosmyki włosów wykorzystywane w badaniach pobrano od 20 osób
uzależnionych od konopi. Próbki zostały
pobrane w dniu analizy, a także po upływie 45 i 90 dni. Próbki włosów zostały pobrane z różnych części głowy ze względu
na zmienną szybkość wzrostu włosów
w tych obszarach. Wartość LOD dla THC
wynosiła 0,1 ng/mg. Zakres stężeń THC
w próbkach włosów mieścił się w zakresie
od 0,16 - 2,3 ng/mg, a obecność THC we
włosach stwierdzano we włosach przez co
najmniej 90 dni od zażycia [2].
Han i wsp. [29] oznaczyli 11-nor-9-
karboksy-Δ9-tetrahydrokannabinolu (THC-
-COOH) we włosach metodą chromatografii gazowej sprzężonej z tandemową
spektrometrią mas działającą w ujemnym
trybie jonizacji chemicznej (GC–MS/MS–
NCI). Badaniu zostały poddane próbki
włosów pobrane od 22 osób i podzielone
na segmenty o długości: 0-3 cm, 3-6 cm,
6-9 cm oraz 9-12 cm. W badaniach stwierdzono, że stężenie THC-COOH zmniejszało się od segmentów bliższych do dystalnych w niemal wszystkich fragmentach, co
obrazuje spadek stężenia narkotyku wraz
z odległością od cebulki włosa. Na podstawie tego stwierdzono, że badane osoby regularnie i w sposób umiarkowany używały
preparaty Cannabis [29].
Także Mercolinia i wsp. [30] zajmowali
się oznaczaniem THC we włosach. Zastosowali technikę LC-MS/MS, która pozwala
nie tylko na oznaczenie THC, ale także
THC-COOH. Dzięki oznaczaniu obu substancji jednocześnie możliwe było wykluczenie biernej ekspozycji na kanabinoidy,
gdyż THC-COOH wytwarzane jest wyłącznie w organizmie. Włosy zostały pobrane
według zaleceń SoHT [16,22] z odcinka
tylnego wierzchołka głowy, od osób przewlekle używających kanabinoidy. Wartość
granicy oznaczalności LOQ wynosiły 3 pg/
mg dla THC i 1 pg/mg dla THC-COOH,
natomiast uzyskane stężenia analitów mieściły się w zakresie od 55 do 100 pg/mg
dla THC i od 5 do 10 pg/mg dla THC-COOC, co potwierdziło przewlekłe stosowanie
THC przez badane osoby [30].
Wada i wsp. [5] oznaczali stymulanty
typu amfetaminowego (ATS) za pomocą
metody HPLC z detekcją chemiluminescencyjną. Próbki do badań zostały pobrane od 32 kobiet pochodzących z różnych
grup etnicznych. Z informacji uzyskanych
Tabela I
Zalecane granice oznaczalności (LOQ) dotyczące badania włosów dla najczęściej oznaczanych narkotyków zgodnie z zaleceniami Society of Hair Testing [25].
Recommendations of limit of quantification (LOQ) for the most frequently detected drugs as recomended with Society of Hair Testing [25].
Substancja
Granica oznaczalności (LOQ)
Metoda immunologiczna Metoda chromatograficzna
Opiaty 0,2 ng/mg
(dla morfiny i 6-acetylmorfiny) ≤ 0,2 ng/mg
Kokaina 0,5 ng/mg ≤0,5 ng/mg dla kokainy
≤0,05 ng/mg dla pozostałych związków
Amfetamina
0,2 ng / mg
(dla każdej substancji musi oddzielnie dawać wynik pozytywny:
MDMA, metamfetamina, MDEA lub MDA)
≤0,2 ng/mg
Kannabinoidy 0,1 ng/mg (THC) THC: ≤ 0,1 ng/mg
THC-COOH: ≤ 0,2 pg/mg
THC – Tetrahydrokannabinol; MDMA – 3,4-Metylenodioksymetamfetamina; MDEA – 3,4-Metylenodioksy-N-etyloamfetamina; MDA – 3,4-Metylenodioksyamfetamina.
J. Margasińska-Olejak i wsp.
Przegląd Lekarski 2018 / 75 / 11 553
od osób badanych wynikało, że zażywały
one substancje psychoaktywne dłużej niż
tydzień przed pobraniem próbki. Podczas
hospitalizacji wykonano badania moczu na
obecność stymulantów, jednak większość
związków nie została wykryta w moczu.
Natomiast zakresy stężeń ATS we włosach
osób wynosiły: 0,07-6,73 ng/mg dla metamfetaminy - MA (n=24), 0,18-2,47 ng/mg
dla amfetaminy - AP (n=13), 0,05-0,86 ng/
mg dla 3,4- metylenodioksymetamfetaminy - MDMA (n=12), 0,52-1,38 ng/mg
3,4- metylenodioksyamfetaminy - MDA
(n=3) i 0,09 - 1,88 ng/mg dla p-metoksymetamfetaminy - PMMA (n=6). Wartości LOD
wynosiły odpowiednio 0,008; 0,027; 0,017;
0,068 i 0,007 ng/mg. Wyniki badań ukazały
ponadto wpływ typu włosa na stężenie narkotyków w ich komórkach. Ciemne i grube
włosy zawierały wyższe stężenie substancji badanych niż włosy cienkie o jaśniejszej
barwie (brązowe lub blond), co potwierdza
teorię o wpływie zawartości melaniny na
stężenie narkotyku we włosach. Ponadto
wskazano, że stosowanie zabiegów kosmetycznych (np. farbowanie lub ondulacja) może mieć wpływ na stężenie ATS we
włosach [5].
Dokładny profil zażywania metamfetaminy z wykorzystaniem analizy włosów
przedstawili w swojej pracy Han i wsp. [31].
Badania miały wskazać, czy wyniki analizy segmentowej włosów mogą obrazować
zażywanie tej substancji psychoaktywnej.
Próbki zostały pobrane od 15 osób i poddane analizie przy użyciu metody GC-MS.
Badano stężenie amfetaminy (AP) i metamfetaminy (MA) oraz wskaźnik AP/MA
w korzeniu włosa, w segmentach o długości 1 cm, w całości włosa oraz w odcinkach
o długości 1-4 cm u osób zażywających
MA. Dodatnie wyniki badań uzyskano dla
wszystkich próbek dla analizy całości włosa, jak i w segmentach. Wyznaczono LOQ
dla MA wynoszące 0,5 ng/mg (przy użyciu metody GC-MS). Uzyskane zakresy
stężeń dla MA i AP wynosiły odpowiednio
3,00-05,10 ng/mg (średnio 34,53 ng/mg)
i 0,05-4,76 ng/mg (średnio 2,42 ng/mg).
Wyniki dla próbek utworzonych z całości
włosa pozwalały wnioskować o używaniu
danej substancji, natomiast wyniki uzyskane dla fragmentów pozwalały na określenie
historii zażywania, np. w okresie miesiąca.
Dzięki analizie segmentowej zróżnicowano
ciągłe stosowanie narkotyku (w przypadku
osób badanych, n=10), użycie jednorazowe w ostatnim czasie bez wcześniejszego
stosowania (n=3) oraz wcześniejsze zażywanie bez użycia w krótkim okresie czasu
przed badaniem (n=2) [31].
W pracy Liu i wsp. [32] wykorzystano metodę LC-MS/MS do jednoczesnego
oznaczenia amfetaminy i opiatów. We
włosach osób uzależnionych oznaczono:
amfetaminę (AP), metamfetaminę (MA),
morfinę (MOR), kodeinę (COD) oraz
6-acetylokodeinę (6-AC). Wszystkie pobrane próbki włosów były w kolorze czarnym, co wykluczyło wpływ stężenia melaniny na wyniki badań. Uzyskane wartości
LOD dla posegmentowanych próbek włosów wynosiły: 2 pg/mg dla AP i MA, 8 pg/
mg dla MOR, COD i 6-AC; LOQ 10 pg/
mg dla wszystkich pięciu analitów. Spośród 86 próbek badanych, zaledwie
dwie (2,33%), uzyskały wynik ujemny
dla wszystkich sześciu substancji. Dodatni wynik uzyskano w n=82 (95,4%),
62 (72,1%) i 61 (70,9%) próbkach odpowiednio dla AP, opiatów i obu kategorii
narkotyków [32].
Publikowane wyniki badań wskazują,
że analiza włosów jest szczególnie przydatna do kontroli abstynencji [34,35]. Jako
jedną z najskuteczniejszych metod leczenia uzależnienia od opioidów stosuje się
terapię substytucyjną metadonem.
Stanaszek i wsp. [33] w swojej pracy
przedstawili znaczenie analizy włosów
w monitorowaniu abstynencji u osób objętych programem metadonowym. W próbkach włosów pobranych od 57 pacjentów
oznaczono zawartość morfiny, 6-monoacetylomorfiny, kodeiny oraz amfetamin,
takich jak efedryna (EP), metkatynon
(MKT), parametoksyamfetamin (PMMA),
amfetamina (AP), metylenodioksyamfetamina (MDA), metylenodioksymetamfetamina (MDMA), metyleno-dioksyetylo-
-amfetamina (MDEA). Oznaczano także
środek zastosowany w terapii - metadon
(MTD). Analizę alkaloidów opium oraz
metadonu przeprowadzono metodą GC-
-MS, natomiast analizę amfetamin wykoTabela II
Narkotyki i poziom ich oznaczalności we włosach.
Drugs and the level of their determination in the hair.
Substancja Rodzaj zastosowanej analizy
instrumentalnej
Zakres oznaczanych
stężeń LOD /LOQ Piśmiennictwo
Morfina
GC-MS 0,26 -2,3 ng/mg 0,26 ng/mg
(LOD) Khajuria i Nayak [28]
LC-MS/MS - 8 pg/mg
(LOD) Liu i wsp. [32]
THC GC–MS 0,16 - 2,3 ng/mg 0,1 ng/mg
(LOD) Khajuria i Nayak [2]
LC-MS/MS 55 - 100 pg/mg 3 pg/mg (LOQ) Mercolinia i wsp. [30]
THC-COOH LC-MS/MS 5 -10 pg/mg 1 pg/mg (LOQ) Mercolinia i wsp. [30]
(GC–MS/MS–NCI) - - Han i wsp. [29]
Metamfetamina
HPLC z detekcją chemiluminescencyjną 0,07 - 6,73 ng/mg 0,008 ng/mg
(LOQ) Wada i wsp. [5]
GC–MS 3,00 - 5,10 ng/mg 0,5 ng/mg
(LOQ) Han i wsp. [31].
LC-MS/MS - 2 pg/mg
(LOD) Liu i wsp. [32]
Amfetamina
HPLC z detekcją chemiluminescencyjną 0,05 - 0,86 ng/mg 0,027 ng/mg
(LOQ) Wada i wsp. [5]
GC–MS 0,05 - 4,76 ng/mg - Han i wsp. [32]
LC-MS/MS - 2 pg/mg
(LOD) Liu i wsp. [32]
MDMA HPLC z detekcją chemiluminescencyjną 0,05 - 0,86 ng/mg 0,017 ng/mg
(LOQ) Wada i wsp. [5]
MDA HPLC z detekcją chemiluminescencyjną 0,52 - 1,38 ng/mg 0,068 ng/mg
(LOQ) Wada i wsp. [5]
PMMA HPLC z detekcją chemiluminescencyjną 0,09 - 1,88 ng/mg 0,007 ng/mg
(LOQ) Wada i wsp. [5]
Kodeina LC-MS/MS - 8 pg/mg
(LOD) Liu i wsp. [32] 6-Acetylokodeina
THC – Tetrahydrokannabinol; THC-COOH – karboksy-tetrahydrokannabinol; MDMA – 3,4-Metylenodioksymetamfetamina; MDA – 3,4-Metylenodioksyamfetamina; PMMA –
4-metoksymetamfetamina.
554
nano przy użyciu LC-MS z wykorzystaniem jonizacji chemicznej pod ciśnieniem
atmosferycznym (APCI). Próbki włosów
zostały podzielone na dwucentymetrowe
segmenty. Obecność metadonu w próbkach potwierdzała stosowane leczenie. Analizy wykazały, że 4% pacjentów
będących w trakcie terapii nie dotrzymywało warunków abstynencji (wynik
oznaczeń substancji psychoaktywnych
w ich włosach był dodatni). Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że
segmentowa analiza włosów może być
z powodzeniem stosowana w przypadku
kontroli abstynencji i przebiegu leczenia
u osób objętych np. terapią metadonową [34]. W tabeli II zestawiono omówione
techniki wykorzystywane do analizy włosów, a także zakresy oznaczanych stężeń
narkotyków i wartości LOD, LOQ.
Wnioski
Przedstawione opracowanie wskazuje,
że włosy są materiałem biologicznym, który może być wykorzystywany w oznaczeniach substancji psychoaktywnych, zwłaszcza jako badanie uzupełniające dla analizy
tradycyjnych materiałów biologicznych takich, jak krew czy mocz. Wykorzystanie
włosów jako materiału do badań zapewnia
ich unikalna budowa umożliwiająca inkorporację środków psychoaktywnych w głąb
struktury. Dużą zaletą stosowania włosów
jest również łatwy sposób ich pobierania
oraz przechowywania. Analiza włosów
pozwala na określenie historii zażywania substancji psychoaktywnych, a także
w przypadku podziału włosów na określone segmenty, istnieje możliwość ustalenia
przybliżonego czasu przyjęcia narkotyku.
Można określić regularność zażywania,
a także wykazać skuteczność stosowanej
terapii uzależnienia. Dzięki analizie włosów
możliwe jest wykrycie przyjęcia substancji
psychoaktywnej w okresie od tygodnia do
nawet 2 lat, co stanowi o długofalowej i retrospektywnej diagnostyce. Niestety analiza włosów niesie za sobą również wiele
ograniczeń. Główną wadą stosowania włosów, jako materiału do oznaczeń substancji
psychoaktywnych jest możliwość zafałszowania wyniku. Przyczynić się może do tego
zanieczyszczenie środowiska, stosowanie
kosmetyków czy zabiegi chemiczne stosowane na włosach. Analiza włosów wymaga zastosowania wystandaryzowanych
metod i przeprowadzeniu wielu badań. Nie
w pełni poznane mechanizmy wprowadzania substancji do macierzy włosowej sprawiają również, że pojawia się także wiele
ograniczeń co do możliwości interpretacji
wyników.
Piśmiennictwo
1. Włodarczyk R: Historia, teraźniejszość i perspektywy kryminalistycznych badań włosów ludzkich.
Wydawnictwo Wyższej Szkoły Policji w Szczytnie.
2007; 9-10: 32-33.
2. Khajuria H, Nayak BP: Detection of D9-tetrahydrocannabinol (THC) in hair using GC–MS. EJFS
2014; 4: 17-20.
3. Pragst F, Balikowa M: State of the art in hair
analysis for detection of drug and alcohol abuse.
Clin Chim Acta. 2006; 370: 17-49.
4. Huestis M: Advantages & disadvantages of drug
testing in alternative matrices. NIDA Washington -
August 5, 2010.
5. Wada M, Sugimoto Y, Crabtree B: Simultaneous
determination of amphetamine-type stimulants in
abusers’ hair: clinical usefulness of hair analysis
in prehospitalization for abusers. Forensic Toxicol.
2013; 31: 2-8.
6. Wiechuła D, Fischer A, Loska K, Widziewicz
K, Górka A: Zinc and lead concentrations in the
pubic hair of women living in areas with different
contamination degrees. Pol J Environ Stud. 2012;
21: 1875-1880.
7. Baumgartner WA, Jones PT, Black C: Detection
of phencyclidine in hair. J Forensic Sci. 1981; 3:
576-581.
8. Kintz P: Value of the concept of minimal detectable dosage in human hair. Forensic Sci Int. 2012;
218: 28-30.
9. Rouen D, Dolan K, Kimber J: A review of drug
detection testing and an examination of urine,
hair, saliva and sweat. NDARC. 2001; 14-17.
http://ndarc.med.unsw.edu.au/sites/default/
files/ndarc/resources/TR.120.PDF [dostęp:
05.01.2018]
10. Kowalczyk P, Manda A, Kościelniak B, Tomasik
P, Sztefko K: Nietypowe materiały biologiczne
pobierane w sposób nieinwazyjny w diagnostyce
laboratoryjnej. Diagn Lab. 2014; 50: 255-262.
11. Łuczak-Zielkiewicz I, Szutowski M: Wartość diagnostyczna włosów. Biul Wydz Farm WUM. 2013;
8: 56-64.
12. Karen S, Robert K, Drug incroporation in hair,
in: P. Kintz (ed.), Analytical and Practical Aspects
of Drug Testing in Hair. CRC Press, Boca Raton,
USA. 2007; 1–23.
13. Hubbard DL, Wilkins DG, Rollins DE: The incorporation of cocaine and metabolites into hair: effects of dose and hair pigmentation. DMD. 2000;
28: 1464-1469.
14. Rollins DE, Wilkins DG, Krueger GG, Augsburger MP, Mizunol A. et al: The Effect of hair color
on the incorporation of codeine into human hair.
J Anal Toxicol. 2003; 27: 545-551.
15. Kintz P, Cirimele V, Jamey C, Ludes B: Testing
for GHB in hair by GC/MS/MS after a single exposure. Application to document sexual assault. J
Forensic Sci. 2003; 48: 1-6.
16. Rossi R, Lancia M, Gambelunghe C, Oliva
A Fucci N: Identification of GHB and morphine in
hair in a case of drug-facilitated sexual assault. Forensic Sci Int. 2009; 186: 9-11.
17. Bertol E, Argo A, Procaccianti P, Vaianoa F, Di
Milia MG. et al: Detection of gamma-hydroxybutyrate in hair: Validation of GC–MS and LC–MS/MS
methods and application to a real case. J Pharm
Biomed Anal. 2012; 70: 518-522.
18. Cooper G, Kronstrand R, Kintz P: Society of hair
testing guidelines for drug testing in hair. Forensic
Sci Int. 2012; 218: 20-24.
19. Kintz P, Cirimele V, Dumestre-Toulet V, Ludes
B: Doping control for nandrolone using hair analysis. J Pharm Biomed Anal. 2001; 24: 1125-1130.
20. Deshmukh N, Hussain I, Barker J, Petroczi A,
Naughton DP: Analysis of anabolic steroids in
human hair using LC–MS/MS. Steroids. 2010; 75:
710-714.
21. Chojnacka K, Saeid A, Michalak I, Mikulewicz
M: Effects of local industry on heavy metals content in human hair. Pol J Environ Stud. 2012; 21:
1563-1570.
22. Vogliardi S, Tucci M, Stocchero G: Sample
preparation methods for determination of drugs of
abuse in hair samples: A review. Anal Chim Acta.
2015; 857: 1-27.
23. Agius R, Kintz P: Guidelines for European workplace drug and alcohol testing in hair. Drug Test.
Analysis. 2010; 2: 367-376.
24. Society of Hair Testing. Recommendations for hair
testing in forensic cases. Forensic Sci Int. 2004;
83–84 http://www.soht.org/images/pdf/Consensus
_on_Hair_Analysis.pdf [dostęp: 29.11.2017].
25. Kłys M, Rojek S, Kulikowska J, Bożek E,
Ścisłowski M: Usefulness of multi-parameter opiates–amphetamines–cocainics analysis in hair of
drug users for the evaluation of an abuse profile by
means of LC–APCI-MS-MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007; 854: 299-307.
26. Witkiewicz Z: Podstawy chromatografii. Warszawa: Wydawnictwo Naukowo Techniczne. 2000; 11-
16, 19-21, 153-160, 220-225.
27. Wennig R: Potential problems with the interpretation of hair analysis results. Forensic Sci Int. 2000;
107: 5-12.
28. Khajuria H, Nayak BP: Detection of drug of abuse
(morphine) in hair. Res J Forensic Sci. 2013; 1: 18-
20.
29. Han E, Chung H, Song J: Segmental hair analysis
for 11-Nor-D9-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic
acid and the patterns of cannabis use. J Anal Toxicol. 2012; 36: 195-200.
30. Mercolinia L, Mandrioli R, Protti M, Contic M,
Serpellonid G. et al: Monitoring of chronic cannabis abuse: An LC–MS/MS method for hair analysis.
J Pharm Biomed Anal. 2013; 76: 119-125.
31. Han E, Yang H, Ilung S: Segmental hair analysis
and estimation of methamphetamine use pattern.
Int J Legal Med. 2013; 127: 405-411.
32. Liu H, Liu R, Lin D.L: Simultaneous quantitation
of amphetamines and opiates in human hair by liquid chromatography–tandem mass spectrometry. J
Anal Toxicol. 2015; 39: 183-191.
33. Fucci N, De Giovanni N: Methadone in hair and
sweat from patients in long-term maintenance
therapy. Ther Drug Monit. 2007; 29: 452-454.
34. Stanaszek R, Piekoszewski W, Karakiewicz B,
Kozielec T: Analiza włosów w kontroli abstynencji
pacjentów programu metadonowego. Probl Forensic Sci. 2002; 50: 17-34.
J. Margasińska-Olejak i wsp.